• 鉄イオンを含む活性酸素除去酵素のFSD2とFSD3遺伝子は葉緑体形成に必須
• 葉緑体の核様体に複合体で共局在し、活性酸素から核様体を保護
• 活性酸素が原因で起こる光合成能力の低下を防ぐ新技術の開発に貢献

1.

背景

活性酸素種（ROS; Reactive Oxygen Species）は、乾燥・塩害・強光などの環境ストレス（非生物ストレス）や病害虫などによる生物学的ストレスにより細胞内に多く作られ、核酸（DNA)へのダメージやタンパク質の酸化、脂質の過酸化を引き起こします。そのため、植物は、よく発達したROSに対する防御システムを持っています。スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）は、ROSを無害化するための抗酸化酵素の1つで、活性酸素（スーパーオキシド）と水を過酸化水素と酸素分子に転換する働きを持っています（図1）。ほとんどの植物は、多くのSODアイソザイム※8を持っており、シロイヌナズナのゲノムでは、少なくとも7つのSODの遺伝子が存在していることが分かっています（図2）。3つのFeSOD遺伝子（FSD1, FSD2, FSD3）と3つのCuSOD遺伝子（CSD1, CSD2, CSD3）と1つのMnSOD遺伝子（MSD1）です。これらのうち、FSDタンパク質とCSD2タンパク質は葉緑体、CSD1タンパク質は細胞質、CSD3タンパク質はペルオキシソーム、MSD1タンパク質はミトコンドリアでそれぞれ働いていると考えられています。これは、スーパーオキシドが発生する植物細胞内小器官それぞれの場で、発生を効率的に消去する機能を発揮させるためであると推察されています。 　SODは、植物体内で生じた活性酸素を除去する第1段階の反応を担うことが古くから知られていましたが、FeSODの各アイソザイムの機能分化やオルガネラ内局在部位、葉緑体内での核様体の活性酸素への保護機構についてはこれまで知られていませんでした。

2.

研究手法と成果

研究チームは、作製したDsタグライン※9を用いた表現型スクリーニングにより、葉が薄緑色の突然変異体を単離し、これがFSD2遺伝子へトランスポゾンDsが挿入したことにより生じたとの発見を手がかりに、この遺伝子の葉緑体内での役割を明らかにしていきました。 　シロイヌナズナのFeSODのほかの2つのメンバーであるFSD1とFSD3遺伝子の変異体の表現型を調べたところ、FSD3遺伝子の突然変異体もFSD2遺伝子の突然変異体と同様に薄緑色になるのに対し、FSD1遺伝子の突然変異体は野生型と比べて変わらないことが分りました（図3）。また、FSD2, FSD3遺伝子の薄緑色変異体では葉緑体の発達に異常が見られ、活性酸素の除去能力が低下しているため、光酸化ストレスに対して感受性を示すことも判明しました。さらに、FSD1、FSD2、FSD3タンパク質と蛍光色素GFPとを連結した融合タンパク質をタバコの葉に一過的に発現させる実験から、FSD1は細胞質に、FSD2とFSD3は葉緑体に局在しており、特にFSD3は葉緑体の核様体と共局在することが分りました（図4）。これらの結果から、FSD2とFSD3は正常な葉緑体の発達に必須であり、葉緑体核様体で有害な活性酸素を除去していることが明らかとなりました。 　FSD2, FSD3遺伝子の変異体では、葉緑体DNAにコードされている葉緑体遺伝子の内、PEP (Plastid-Encoded RNA Polymerase)※10 により転写される遺伝子の発現が低下しており、葉緑体転写システムが異常になっていることが分かりました。また、FSD2とFSD3は葉緑体内でヘテロ複合体を形成し、そのためどちらか片方の機能が失われると葉緑体の発達が異常になることも判明しました。さらに、FSD2とFSD3の2つの遺伝子を高発現させた高発現植物体は、活性酸素を大量に発生させる薬剤の存在下においても光合成の活性低下が抑制されることを突き止めました。これらの結果から、FSD2とFSD3のヘテロ複合体は、葉緑体核様体でのPEPによる発現をROSから保護し、光合成反応へのダメージを防ぐ役割を担っていることが明らかとなりました（図5）。

3.	今後の期待
	今回の研究成果は、光合成により発生したROSから、葉緑体の発達初期に葉緑体核様体を保護するという活性酸素除去酵素FSD2とFSD3の新規の役割を明らかにしました。さらに、FSD2とFSD3の複合体は、強光や乾燥などの厳しい環境条件化で発生するROSのダメージが原因のストレスに、耐性を持つ植物体を改良するための標的となる可能性が期待できます。今後、活性酸素除去酵素の葉緑体内での機能解析を進め、厳しい環境ストレス条件下でも光合成能力の低下を引き起こさない植物の作出への応用を目指します。

<補足説明>

※1	シロイヌナズナ
	学名はArabidopsis thaliana (L.) Heynh.アブラナ科一年生草本植物。双子葉植物のモデル植物として2000年にゲノム解読が行われ、ゲノムサイズは約1.3億塩基対、全遺伝子数は約30,000個であることが判明している。
※2	活性酸素
	酸素は酸素分子のO2では比較的安定であるが、電荷が不安定で化学的に活性になったものが活性酸素。非常に強い酸化力を持ち、細胞膜のリン脂質を酸化させたり、タンパク質やDNAに酸化障害を与えたりするなどして植物体に悪影響を与える。スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素の大きく4種類の化合物が知られている。活性酸素は乾燥や低温などの環境ストレスや病害虫による感染や光合成などにより植物細胞内で多く作り出される。
※3	ヘテロ複合体
	異なるタンパク質とタンパク質が結合して複合体を形成したもの。細胞内のタンパクの中にはホモ（同じタンパク質との結合）あるいはヘテロ（異なる2つのタンパク質との結合）のタンパク質複合体を形成し、機能を発揮する例が多く知られている。
※4	葉緑体核様体
	葉緑体のDNAはDNA結合タンパク質によって大きな複合体を形成し、葉緑体核様体と呼ばれる。細胞核の染色体と同様、葉緑体核様体は葉緑体DNAの複製、転写、分配といった機能的な単位となっている。ただし、ヒストンは含まれない。
※5	光合成
	植物においては、光エネルギーから変換した化学エネルギーを使って、水と空気中の二酸化炭素から炭水化物（糖類：例えばショ糖やグルコースやデンプン）と酸素を合成する反応。緑色植物ではこの反応は葉緑体で行われる。
※6	形質転換植物体
	植物体の遺伝子の機能の探索や有用な植物体を作出する目的で、遺伝子工学的手法を用いて外来遺伝子を導入した植物体。植物体によく用いられている形質転換法の1つとして、アグロバクテリウムを用いて遺伝子を導入する方法がある。例えば、発現抑制遺伝子カセット、過剰発現遺伝子カセットなどを含むバイナリーベクターを用いてアグロバクテリウムによる形質転換で遺伝子を植物体に導入し、野生型よりも遺伝子の発現が低下した植物体を作り出したり、逆に遺伝子の発現を向上させた植物体を作り出したりすることができる。
※7	金属イオンが異なる3つのSOD
	活性中心に銅(II)イオンと亜鉛（II）イオン（Cu/ZnSOD）、またはマンガン（III）イオン（MnSOD）や鉄（III）イオン（FeSOD）をもつSOD。
※8	アイソザイム
	酵素としての活性がほぼ同じでありながら、塩基配列がわずかに異なる遺伝子にコードされ、アミノ酸配列の一部が異なるタンパク質。このような同じ酵素活性を持つ一群の酵素を言う。
※9	Dsタグライン
	遺伝子の機能探索を行うためのリソースとして、理研植物科学研究センターで作製した約12,000ラインの突然変異体のコレクション。シロイヌナズナゲノムの色々な位置にDsトランスポゾンと呼ばれる転移因子が挿入しており、特に遺伝子の内部にDsが挿入した変異体は、その遺伝子の機能が失われることになる。
※10	PEP (Plastid-Encoded RNA Polymerase)
	植物細胞の中で、葉緑体やミトコンドリアは固有のゲノムを持ち、それぞれ転写・翻訳されタンパク質を作っている。葉緑体DNAには約80種のタンパク質コード遺伝子がある。高等植物の葉緑体では、葉緑体DNAにコードされているバクテリア型RNAポリメラーゼ（PEP）と、核DNAにコードされているファージ型RNAポリメラーゼ（NEP）の働きにより、DNAからRNAへの転写が起こる。葉緑体分化過程において、これら2種のRNAポリメラーゼの内、最初にNEPが活性化され、引き続いてPEPの活性化が起こり、葉緑体DNAの転写パターンが著しく変化している。

図1　SOD（スーパーオキシドディスムターゼ）の働き

SODは、植物体で発生するスーパーオキシドを過酸化水素と酸素にする反応を担っている。スーパーオキシドは、生物学的・非生物学的ストレスなどにより大量に植物細胞中に蓄積する。SODは、これを消去することができる。

図2　シロイヌナズナと異なる種の SOD 遺伝子ファミリーの系統樹

SODは内部に配位する金属によって、鉄イオンを含むFeSOD、銅や亜鉛イオンを含む Cu/ZnSOD、マンガンイオンを含む MnSOD、の3つに分けられる。系統樹は、シロイヌナズナとほかの生物のSOD遺伝子の完全長cDNAの塩基配列を使って Neighbor-joining 法で作製したもの。At、Ec、Os、Ss の各遺伝子は、それぞれシロイヌナズナ、大腸菌、イネ、ラン藻にコードされていることを示す。

図3　野生型とFSD遺伝子変異体の表現型

2つの生態型（エコタイプ）が異なる野生型植物体と3つのFSD遺伝子（FSD1、FSD2、FSD3）の異常変異体およびFSD2とFSD3の両方の遺伝子が異常になっている変異体の写真。FSD1遺伝子の変異体は野生型と比べて変化は見られないが、FSD2とFSD3遺伝子の変異体は薄緑色になっている。さらにFSD2とFSD3の2つの遺伝子がともに異常になっている変異体は、葉の色がさらに白色化している。このことから、FSD2遺伝子とFSD3遺伝子の両方が正常な葉緑体の発達に必須であることが分かる。

図4　FSD1, 2, 3タンパク質の細胞内局在
A:	FSD1、FSD2、FSD3と蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質をタバコ表皮細胞中で大量に発現させ、蛍光顕微鏡で観察したもの。これによりGFPと融合させたタンパク質の細胞内での局在を調べることができる。融合していないGFPだけを発現させた蛍光シグナルをコントロールにしている。GFPとFSD1-GFPは、葉緑体の自家蛍光（赤）以外の核と細胞質にGFP蛍光（緑）が見られる。一方、FSD2-GFPとFSD3-GFPは葉緑体の自家蛍光と重なっている。このことから、FSD2とFSD3は葉緑体に局在していることが分かる。
B:	FSD3-YFPの蛍光（黄）は、細胞核を除いてPEND-CFPの蛍光（青）と一致している。PENDは、葉緑体DNA結合タンパク質として知られ、このことから、FSD3は葉緑体核様体と共局在することが分かる。

図5　FSD2と3タンパク質の葉緑体内での役割のモデル

FSD2とFSD3はヘテロ複合体を形成し、核様体に共局在していることが明らかになった。FSD2とFSD3のヘテロ複合体は、CSD2と共に光合成で作り出されるスーパーオキシドを過酸化水素に変換して、スーパーオキシドの葉緑体内での蓄積を防いでいる。また、外部からのさまざまなストレスで大量に発生するスーパーオキシドを消去している。これにより、 FSD2とFSD3は、核様体で行われるPEPによるRNAの転写機能を有害な活性酸素から防御し、光合成の低下を防いでいると考えられる。