1.

背　景

体内時計システムはバクテリアからハエ、マウス・ヒトなど多くの生物種に存在するシステムです。哺乳類の場合、この体内時計システムによって作り出される約24時間の体内リズムは、視交差上核などの各器官で様々な遺伝子が約24時間周期で振動することによって作り出され、睡眠・覚醒、血圧・体温、ホルモン分泌といった生理機能に影響を与えていると考えられています。 　遺伝子の約24時間周期の振動を司る体内時計システムは、複雑な遺伝子ネットワークからなっていると考えられています。この時計の遺伝子ネットワークを解明するため、同チームはこれまでの研究で定量的かつ包括的な測定手法を用い、体内時計の構成要素として16個の時計遺伝子を抽出しました（図１）。これらの時計遺伝子の大部分は一日の決まった時間に合成され、朝・昼・夜といった時間に特徴的な発現を示します。研究チームは、それらの朝・昼・夜の時計遺伝子の発現を制御する領域において、ヒトとマウスで進化的に保存されている朝・昼・夜の３種類の発現制御配列、朝配列（E-box/E'-box）、昼配列（D-box）夜配列（RRE）を見出しました。さらにこれら３つの発現制御配列と16の遺伝子の相互作用を調べた結果、朝配列の制御がネットワークの中心的役割を担っていることが示唆され、朝配列の活性化／不活性化の切り替えリズムそのものが細胞のリズムや個体のリズムに必要不可欠だと予測されました。実際に朝配列に対する不活性化因子を過剰に細胞内に発現させたところ細胞全体のリズムが崩壊しましたが、他の２つの制御配列に対する不活性化因子を過剰に発現させてもそのような広範な変化は見られませんでした。これらのことから、朝配列の活性化がおこらないと哺乳類細胞の体内時計が機能しないことが明らかになりました。しかしながら、朝配列の活性化と不活性化の切り替えリズムが細胞の体内リズムの維持のために必要である直接の証拠を示すのは難しく、これまで体内時計システムを理解するうえでの課題のひとつとなっていました。

2.

研究手法と成果

朝配列の活性化／不活性化の切り替えリズムの重要性を直接的に示すには、これまでの実験に加えて、朝配列の不活性化のみをおこらないようにする実験が求められていました。 そこで、研究チームは、最先端の方法を用いて16個の時計遺伝子のうち、朝配列（E-box）の活性化を担う時計遺伝子（Bmal1遺伝子, Clock遺伝子）をランダムに改変し、朝配列の活性化は正常で不活性化のみがおこらないような変異遺伝子を探し出しました。具体的には、実験ロボットを用いてランダムに改変したそれぞれ約6000個の変異型時計遺伝子（変異型Bmal1遺伝子, 変異型Clock遺伝子）をひとつひとつ丹念に調べあげ、その中から朝配列（E-box）の不活性化のみがおこらない３つの変異型Clock遺伝子および４つの変異型Bmal1遺伝子を選び出しました（図2）。これらの変異型Clock遺伝子および変異型Bmal1遺伝子は、不活性化遺伝子（Cry遺伝子、Per遺伝子）に対する反応性が低下しているために朝配列の不活性化のみがおこりません。 　研究チームは、朝配列の不活性化の欠如が哺乳類細胞の体内リズムにどのような影響をあたえるかを検証するために、バイオインフォマティクスを用いて細胞のリズムを正確かつ効率的にモニターする技術を開発しました。変異型時計遺伝子の様々な組み合わせを培養細胞に導入し、この方法を用いることで細胞全体の体内リズムを正確に調べたところ、不活性化遺伝子に対する反応性が低いほど朝の時計遺伝子や夜の時計遺伝子等の発現リズムが消失する事実を発見しました（図3）。このことから、朝配列の不活性化のみがおこらなくても細胞の体内リズムが消失する可能性が示唆されました。しかし、今までの細胞のリズムを測定する方法では、多数の細胞が作り出す全体的なリズムを観察しており、見かけ上の細胞リズムの消失の原因として、(1)細胞１つ１つの時計リズムが消失している可能性以外にも、(2)各細胞のリズムが少しずつずれてしまったために全体としてはあたかもリズムが消えてしまったように見えている可能性も否定できません。そこで研究チームは、最新の観察技術によって、細胞１つ１つのリズムを詳細に測定し、この改変遺伝子を導入した場合、細胞１つ１つのリズムが完全に消失していることを確認しました（図4）。 　この結果から、研究チームが見いだした時計の心臓部である朝配列（E-box） の活性化／不活性化の切り替えリズムが細胞全体のリズムを作り出すのに重要であることが世界で初めて証明されました。

3.

研究成果の意義と今後の展開

体内時計システムを完全に理解するには引き続き体内の一日が決定されるメカニズムを明らかにしていく必要がありますが、今回体内時計システムにおける朝配列の活性化／不活性化の切り替えリズムの特別な役割が直接証明されたことで、複雑な哺乳類の体内時計システムの理解に一歩近づいたといえます。このように体内時計の仕組みが明らかになることによって、体内時刻に合わせた薬剤投与を実現する最適化医療や、不眠症・鬱症状・不登校の一部の原因であると考えられているリズム障害の詳細な診断やリズム障害治療薬の探索が可能になることが期待されます。 　また今回開発された細胞のリズムを正確かつ効率的にモニターする技術は、体内時計システムの解明やリズム障害治療薬の探索に大きな力を発揮することが期待されます。研究チームは、この技術を用いたリズム治療薬の探索プロジェクトを4月から本格的に開始する予定です。さらに、今回開発された実験ロボットを用いて遺伝子の機能改変を行う技術は、これまで難しいとされてきた哺乳類遺伝子の機能改変を行う技術として汎用性があり、今後この技術が応用されることによって様々な生命現象の理解や病態の解明へとつながることが期待されます。

図1　これまでに明らかになっていた哺乳類体内時計の遺伝子ネットワーク

ネットワークの中で重要な役割をしていると予測される朝配列（Ｅ-box/E'-box）はClock遺伝子、Bmal1遺伝子を含めた９つの時計遺伝子によって活性化（緑色）・不活性化（赤色）され、９つの遺伝子の発現を制御している（灰色）

図2　朝配列の不活性化のみが起こらない変異型時計遺伝子

>> 拡大図

図3　変異型時計遺伝子による朝の遺伝子と夜の遺伝子のリズムの消失

>> 拡大図

図4　変異型時計遺伝子による細胞１つ１つのリズムの消失