• 特定の立体構造に折りたたまれるアミノ酸配列の設計法を確立。
• 全配列設計・全合成した人工タンパク質の溶液構造を決定。
• 複雑な折りたたみ構造の設計に日本で初めて成功。

1.

背　景

酵素や転写因子などの天然タンパク質が示す洗練された機能は、それらの分子に特有な立体構造特性に依存しています。とくに、分子量が大きく、多数の疎水性残基を含んでいるにもかかわらず、水溶液の中で高い溶解度を示し、単一な立体構造を形成することは、天然の球状タンパク質がもつ優れた分子物性の核心です。天然タンパク質のこれらの性質のおかげで、NMRやＸ線結晶構造解析を使って、その立体構造を知ることが可能となります。タンパク質分子が、これらの特性を実現するためのアミノ酸配列を決定することが、研究グループのデノボタンパク質設計（de novo protein design）の目標です。 　球状タンパク質は一般的に、複雑な折りたたみ構造をもっているために、これをデザインするためには、計算機の利用が欠かせません。これまで、このような手法で設計された人工タンパク質の多くは、実際に合成してみると、安定な主鎖の折りたたみ構造をもっている場合でも、天然タンパク質に較べて側鎖の構造揺らぎが大きく、水に対する溶解度は低いものでした。このために、せっかく合成しても、NMRやX線結晶構造解析によって詳細な立体構造決定が出来ませんでした※２。それゆえ、立体構造情報に基づいて、構造特性を再設計することも、機能化の再設計を行うことも出来ませんでした。研究グループは、こうした問題を解決するために、理論計算と合成、解析を繰り返すことによって設計法の改良を行い、NMRを用いて溶液構造が決定できるような単一な立体構造に折りたたまれる人工タンパク質の設計を目指しました。

2.

研究手法と成果

具体的には、図1に示すような計算科学的手法を用いて、任意の立体構造に折りたたまれるアミノ酸配列を設計する方法を考案しました。この方法は、作りたい立体構造の中にある各アミノ酸部位の埋もれ度や二次構造、アミノ酸残基間の親和性など、タンパク質の分子内環境に適合したアミノ酸を選んで並べていくことによって、人工的なアミノ酸配列を設計するものです。設計した人工タンパク質の合成と構造物性の解析を行い、結果を設計法にフィードバックします。これを繰り返すことによって、設計法の改良を行い、分子内環境と各アミノ酸の適合性の見積もりを正しく出来る様になりました。タンパク質の全合成は、化学合成DNAから人工遺伝子を作成し、ベクターを使って大腸菌に導入・発現することよって行いました。上記の改良した設計法を用いて、λファージのDNA結合タンパク質（λCro）の立体構造を最適化するアミノ酸配列の設計を行いました。λCroは、二次構造としてαヘリックスとβシートをもつ古典的な転写因子です。λCroの複雑な折りたたみ構造は、DNAの２重らせん構造の中の大きな溝にフィットするよう精妙にデザインされており、その生理活性を直接反映している点に注目して、設計のターゲットとして選びました。合成された人工タンパク質は、これまでの人工タンパク質に特有の問題点である過度の構造揺らぎが解消されており、良好な構造物性を示す単一な立体構造を形成しました。そこで、NMR分光法を使って、その溶液構造を決定しました（図2左）。得られた立体構造は、設計のターゲットとした天然λCroモノマー変異体のＸ線構造と比較して、良い精度で一致していました（図2右）。

3.	今後の期待
	従来のタンパク質工学では、自然選択の結果生成した天然タンパク質のアミノ酸配列を部分的に改変する研究が主流でしたが、本研究では、特定の立体構造に折たたまれるタンパク質のアミノ酸配列全体を、人間が「はじめから」設計出来ることを示しました。国家プロジェクトである「タンパク3000プロジェクト」をはじめとして、昨今のタンパク質構造に関するデータが蓄積されてきたことによる、タンパク質研究の大きな進展であると言えます。本研究で得られた成果を発展させることで、将来、環境ホルモンを効率良く分解する酵素や病原遺伝子の発現を特異的に阻害する薬物タンパク質など、天然には存在しない新しい機能をもつ人工タンパク質を設計できるようになることが期待されます。

<補足説明>

※1	大腸菌を宿主とする代表的な細菌ウイルス。このファージに関する遺伝生化学的研究により、生物学上の重要な法則と知見が得られている。λCroタンパク質は、JacobとMonodによるオペロン説（タンパク質の発現調節機構に関する学説）の中で重要な役割を果たす。
※2	これまでにNMRやX線結晶構造解析によって詳細な立体構造が決定された人工蛋白質は数例あるが、本研究で設計された立体構造はこれまでで最も非対称で複雑な折りたたみ構造をもつ（図２）。