• 色素性乾皮症の欠損因子であるXPC複合体とUV-DDBが協力して働く修復ﾒｶﾆｽﾞﾑを解明
• 紫外線によるDNA損傷を効率よく修復するにはユビキチン化が重要
• 皮膚がんの予防法の開発への応用も期待される

1.

背　景

細胞に紫外線が当たると、ピリミジン塩基（シトシンまたはチミン）が2個連続した場所で特徴的なDNA損傷が発生します（図１）。このような損傷は、ヌクレオチド除去修復（NER、図２）と呼ばれる機構によって元通りに修復されます。色素性乾皮症（XP）の患者ではこの修復機構が遺伝的に欠損しているため、皮膚細胞が日光にさらされた時にできるDNA損傷を十分修復することができません。そのため、XP患者は非常に皮膚がんを起こしやすいことが知られています。 つまり、NERは私たちを皮膚がんから守ってくれる重要な防御機構として働いているのです。 　DNA修復では、巨大なゲノムDNAに発生した損傷をどうやって効率よく見つけ出すか、その最初のステップが重要な鍵を握っています。ヒトのNERでこの過程に必要不可欠なのが、XPの原因遺伝子産物の一つであるXPCタンパク質を含む複合体です。研究グループの菅澤 薫副主任研究員らは、XPC複合体が紫外線による損傷だけでなく、化学物質などが塩基に結合することによって発生する様々なDNA損傷を認識して、特異的に結合する性質を持つことをこれまで明らかにしてきました。 一方、紫外線損傷に対してXPC複合体よりもさらに強力に結合できる別の因子として、UV-DDB（UV-damaged DNA-binding protein）が以前から知られていました（図３）。 UV-DDBはDDB1とDDB2の2つのサブユニットからなる複合体で、DDB2はXPの原因遺伝子産物の一つ（XPE）です。UV-DDBはNERに必ずしも必須ではありませんが、XPC複合体による損傷の認識を補助することで修復を促進するものと考えられてきました。しかし、実際にXPC複合体とUV-DDBの機能がお互いにどのように関わっているのかについては、これまでわかっていませんでした。

2.

研究手法と成果

今回研究グループは、ヒトの培養細胞に紫外線を照射した時にXPCタンパク質の一部がユビキチン化されることにより、電気泳動上の移動度が遅くなることに気づきました（図４左）。タンパク質のユビキチン化に関する研究は2004年のノーベル化学賞の授賞対象にもなりましたが、近年さらに、生物の様々な機能の調節に重要な役割を果たしていることが急速に明らかになっています。 特にユビキチン化の機能としては、タンパク質を分解に導く引き金となることがよく知られていますが、実験を重ねた結果、XPCタンパク質の場合はユビキチン化されても分解されるわけではなく、時間が経つと脱ユビキチン化されて再び元の状態に戻ることがわかりました。 　このXPCタンパク質のユビキチン化を様々な細胞を使って調べたところ、興味深いことにDDB2の異常によりUV-DDBが欠損しているE群XP患者由来の細胞やチャイニーズ・ハムスター由来の細胞ではユビキチン化が起こらないことがわかりました（図４右）。これらの細胞に正常なヒトDDB2遺伝子を導入するとXPCタンパク質のユビキチン化も回復したことから、UV-DDBがXPCタンパク質のユビキチン化に必要であることが明らかになりました。 さらに、XPC複合体とUV-DDBが直接物理的に相互作用することが、抗体を使った共沈降実験によってはじめて示されました。 　一方、UV-DDBが細胞内において、ユビキチンをタンパク質に結合させるのに必要な酵素の一つであるユビキチン・リガーゼ（E3）と複合体を形成していることが2003年に報告されていました。研究グループはこのUV-DDB-E3複合体を精製し、試験管の中でXPCタンパク質のユビキチン化を再現することに成功しました。この時XPCタンパク質だけでなく、DDB2も同時にユビキチン化されることがわかりました。次に、XPC複合体とUV-DDB、それぞれのDNA損傷に対する結合が、ユビキチン化によってどのような影響を受けるかを解析しました。 その結果、DDB2がユビキチン化されるとUV-DDBはもはやDNA損傷に結合できなくなるのに対して、XPC複合体はユビキチン化されても依然としてDNA結合能を保持していることがわかりました。さらに、試験管内で紫外線損傷のNER反応を行ったところ、UV-DDBを反応系に加えた場合に限り、ユビキチン化を阻害することによって修復反応も阻害されてしまうことが明らかになりました。 　細胞内で発生した紫外線損傷を長大なゲノムDNAの中から効率よく見つけるには、損傷に対して非常に強力に結合する性質を持つUV-DDBのような因子が有利です。損傷に結合したUV-DDBはタンパク質間相互作用によってXPC複合体を呼び寄せると考えられますが、両者の損傷に対する結合力に大きな差があるため、そのままではXPC複合体がUV-DDBと入れ替わることができず、結果として修復反応を先に進めることができません（図５右）。 今回の結果は、ユビキチン化によってUV-DDBとXPC複合体のDNA損傷に対する結合の強さが逆転することを示しており、ユビキチン化の助けを借りることでXPCがUV-DDBと入れ替わることが可能になると考えられます（図５左）。このようなメカニズムによって損傷がUV-DDBからXPC複合体にスムーズに受け渡され、修復反応が開始されることがわかったと同時に、ユビキチン化の機能としても従来知られていない新たな側面が明らかになりました。

3.	今後の展開
	オゾン層の破壊などにより、紫外線による皮膚がんの発生が人類にとって今後大きな脅威となる可能性があります。紫外線によるDNA損傷を修復するメカニズムを理解することにより、XPなどの病気の治療にとどまらず、本来正常な細胞が持つ修復活性をさらに高めることによって皮膚がんの予防につなげられるかも知れません。例えば、今回新たに見出したUV-DDBとXPCとのタンパク質間相互作用、あるいはUV-DDBに依存したユビキチン化を促進するような化合物や因子が見つけられれば、それを皮膚がんの予防薬として応用できる可能性もあると期待されます。

<補足説明>

※1	色素性乾皮症（xeroderma pigmentosum: XP）
	ヒトの常染色体性劣性遺伝疾患で、皮膚の露光部での様々な光線過敏症状、特に皮膚がんの発症を特徴とする。現在までにXPA、XPB、XPC、XPD、DDB2 (XPE)、XPF、XPG、XPVの8種類の原因遺伝子が同定されており、このうちXPVを除く7種類の遺伝子はいずれもヌクレオチド除去修復機構に関わるタンパク質をコードしている（図１）。
※2	XPCタンパク質複合体
	XPC遺伝子がコードするXPCタンパク質は、出芽酵母のRad23pに相同性を持つHR23タンパク質、およびcentrin 2と結合したヘテロ三量体として細胞内で存在している。XPCタンパク質はDNA損傷に結合する活性を担っており、この複合体が損傷部位 に結合することがその後の修復反応には必須である。
※3	ユビキチン化
	タンパク質の翻訳後修飾の一種で、76個のアミノ酸からなるユビキチンのカルボキシル末端が、別のタンパク質のリジン残基側鎖のアミノ基とイソペプチド結合により枝分かれ状に結合したもの。ユビキチンが1分子だけ結合する場合（モノユビキチン化）と、ユビキチンにさらにユビキチンが結合することによって鎖状に伸長する場合（ポリユビキチン化）がある。

図１　紫外線によって発生する代表的なDNA損傷

同一のDNA鎖内で連続した２個のピリミジン塩基（シトシンまたはチミン）が、 共有結合によって二量体を形成する（ここではチミン二量体の化学構造を示した）。 このような損傷が生じると、DNA複製や転写の妨げとなり、細胞死や突然変異、染色体の不安定化など、様々な弊害を細胞にもたらす。dR：デオキシリボース残基　P：リン酸基

図２　哺乳類ヌクレオチド除去修復の反応機構のモデル

哺乳類のヌクレオチド除去修復には、ゲノム全体を対象とする修復と転写と共役した修復という2種類の経路が存在する。 このうち前者においては、XPCタンパク質複合体がDNA損傷に結合することがその後の修復反応に必須である。

図３　紫外線損傷に対するXPC複合体とUV-DDBの結合性の比較

代表的な紫外線損傷であるCPD、および（6-4）光産物（図１）を1個含むDNAを用いて、 ゲルシフト法によりXPC複合体とUV-DDBの結合を調べた。 UV-DDBの方がXPC複合体よりも損傷認識能力が圧倒的に高いことがわかる。

図４　細胞の紫外線照射に伴うXPCタンパク質のユビキチン化

左： ヒトの培養細胞株（WI38 VA13）に紫外線（10 J/m2）を照射した後、経時的に細胞抽出液を作成し、そこに含まれるXPCタンパク質をイムノブロッティングによって検出した。照射後1時間程度をピークとして、ユビキチン化による移動度の遅い複数のバンドが出現している。HR23BやXPAタンパク質では、同様の修飾は見られない。 右： XP患者由来の細胞を使って、左と同様の実験を行った。XPAやXPBに欠損を持つ細胞（上段）では正常細胞と同様にXPCのユビキチン化が起こるのに対して、UV-DDBを欠損したXP-E群細胞（下段）では応答が見られない。矢印は通 常の泳動度を示す未修飾タンパク質のバンド、括弧はユビキチン化されたXPCタンパク質のバンド、星印は抗体と交差反応する非特異的なバンドをそれぞれ示す。

図５　ヌクレオチド除去修復の損傷認識過程におけるユビキチン化の役割