要旨
独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、蛍光イメージング解析により、刺激を受けた神経細胞の分泌顆粒が放出するBDNF（脳由来神経栄養因子）※1の量が、分泌調節因子CAPS2※2の働きによって増強する動態を初めてとらえることに成功しました。これは、理研脳科学総合研究センター（利根川進センター長）分子神経形成研究チームの古市貞一チームリーダー、篠田陽客員研究員らの研究成果です。
BDNFは、神経細胞の生存・分化、神経回路の発達・機能などの調節に必須な分泌性のポリペプチドで、精神神経疾患（うつ病、統合失調症、発達障害、アルツハイマー病など）との関連も示唆される重要な神経栄養因子の1つです。このBDNFは、神経細胞の軸索※3に分布する分泌顆粒「有芯小胞※4」に含まれており、脱分極刺激※5を受けると有芯小胞が細胞膜外に開口してBDNFを分泌（開口放出※6）します。この開口放出には、CAPS2が関与すると考えられていましたが、これまでCAPS2がBDNFの分泌をどのように増強するのか、神経細胞上で促進している様子やその時系列的変化については不明のままでした。
研究チームは、CAPS2遺伝子欠損マウスの海馬※7由来の神経細胞を用いて、BDNFの分泌を蛍光イメージングで解析したところ、CAPS2の存在がBDNF分泌の動的速度を約30％、頻度を約85％、量を約60％増強していることを明らかにしました。また、CAPS2遺伝子欠損マウスでは、海馬のGABA（γアミノ酪酸）※8作動性の抑制性神経回路が脆弱になるとともに、抑制性シナプス発達、抑制性シナプス電流、シナプス可塑性、脳波に異常を示し、さらに、新奇オブジェクトを設置した不慣れな環境下で不安様行動を亢進することも明らかにしました。
今回の研究成果は、CAPS2の分泌増強効果の欠損が、BDNF分泌の減弱を引き起こしてGABA作動性の抑制性神経回路を脆弱にし、全般性不安障害やパニック障害といった不安障害※9を発症するリスクの可能性を示しました。今後、不安障害だけでなく、BDNFとの関連が示唆されるうつ病や統合失調症、自閉症の一種であるレット障害、アルツハイマー病などの精神神経疾患でも、CAPS2の分泌増強効果を利用した臨床への新しい応用・開発が期待できます。
本研究成果の一部は、独立行政法人科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業チーム型研究（CREST）の研究課題「BDNF機能障害仮説に基づいた難治性うつ病の診断・治療法の創出」（研究代表者：小島正己 独立行政法人産業技術総合研究所 研究グループ長）の分担研究によって得られ、米国科学アカデミー紀要『Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: PNAS』12月20日の週にオンライン掲載されます。
背景
脳を構成する神経細胞には、小型（直径約50nm）のシナプス小胞※4と大型（直径約80～120nm）の有芯小胞という2つの袋状の構造をした分泌小胞が存在します。有芯小胞には、カテコールアミン（ドーパミンやノルエピネフリンなど）や神経ペプチドが含まれており、この有芯小胞の膜が細胞外に開口して分泌物質を放出します（開口放出）。脳由来神経栄養因子BDNFもこの有芯小胞の開口放出で分泌され、約1,300個のアミノ酸からなる分泌調節因子CAPS2が、この過程に作用すると考えられています（図1）。BDNFは、神経細胞の生存と分化、神経回路の形成、シナプスの可塑性などを調節する上で必須な生理活性を持っており、精神神経疾患との関連も示唆されている重要な神経栄養因子の1つです。これまで研究チームは、CAPS2がBDNFを含む有芯小胞の膜に会合した後、例えば高濃度な塩化カリウム（KCl）処理により有芯小胞が脱分極刺激を受けると、細胞内Ca2+が増加してBDNFの分泌活性が促進すること、CAPS2遺伝子欠損マウスが神経細胞やシナプスの発達異常、社会性行動の欠損や不安様行動の増加を発症すること、さらには自閉症患者の中にCAPS2亜型の発現に異常を持つ人が存在すること、などを報告してきました（2007年3月23日プレス発表）。
しかし、どのようにCAPS2がBDNFの分泌を促進するのか、分泌を制御するメカニズムや細胞における分泌の動態についての詳細は不明でした。また、CAPS2のBDNF分泌増強効果が、細胞生物学的にどのような影響を及ぼすかということもよく分かっていませんでした。研究チームは、発達障害や不安障害に関係する脳回路の正常な発達と働きを理解する上で、これらの問題を解決することが重要であると考えました。
研究手法と成果
（1）神経細胞におけるBDNF分泌のイメージング
神経細胞の内と外のpHの値は約7と中性に保たれていますが、分泌小胞の内部は約5.5と一般的に酸性に偏っており、この性質を利用して有芯小胞内外のBDNFをイメージングすることができます（図2）。具体的には、BDNFとpH感受性蛍光タンパク質（pHluorin）を融合した組み換えタンパク質「BDNF-pHluorin」をマウスの海馬由来の神経細胞に発現させます。このBDNF-pHluorinは、酸性の有芯小胞内にあるときは消光しており、中性である細胞外に放出されるとその放出部位で斑点状の蛍光を発します。高濃度KClで神経細胞を脱分極刺激すると、有芯小胞が開口してBDNF-pHluorinを細胞外に放出するので、刺激前後にわたって、神経細胞の神経突起上で微弱な蛍光の出現と変化を観察することができます。この蛍光斑点の経時的な動態を高感度なカメラで記録しました。
実験には、CAPS2遺伝子欠損マウスの海馬由来初代培養神経細胞（CAPS2－）を使用しました。この細胞にCAPS2遺伝子を外部から導入し（CAPS2+）、CAPS2－細胞と比べました（図3）。CAPS2+細胞とCAPS2－細胞にBDNF-pHluorinを発現させて、脱分極刺激によって発生する蛍光がピークになるまでの時間、その動的速度（時定数）と頻度、そして蛍光斑点の一定時間当たりの数とシグナル強度（分泌量に相当）などについて比較しました。その結果、CAPS2+細胞の場合は、一定時間当たりのBDNFの動的速度（時定数）を約30％加速（図3B）、分泌頻度を約85%増加（図3C）、1つの蛍光斑点あたりのシグナル強度（分泌量に相当）を約60％増大（図3D）することが分かりました。
（2）海馬GABA抑制系の細胞生物学的な意義
CAPS2遺伝子欠損マウスの海馬由来の神経細胞を解析したところ、興奮性よりも抑制性の神経細胞の異常が顕著であることが分かりました。具体的には、正常マウスと比べてCAPS2遺伝子欠損マウスの海馬CA1領域では、GABA作動性の抑制性神経細胞の数が生後28日で約20％減少し（図4A）、GABA抑制性シナプスの数も約20％減少することが分かりました。また、電子顕微鏡による微細組織形態の解析により、抑制性シナプスにおけるシナプス小胞の数が生後56日で約35％減少し、シナプス小胞分布領域も約30％減少（図4B）することも分かりました。さらに、海馬の急性スライス組織標本を用いた電気生理学的な解析により、抑制性シナプス後電流※10の頻度が約65%、振幅が約20%減少すること（図4C）、海馬CA3領域からCA1領域へ投射されるシナプス間の可塑性が低下すること、この可塑性の低下はGABA受容体阻害剤を添加すると正常マウスと同じ増強レベルになること、なども見いだしました。生きたマウスの海馬からの脳波も観測したところ、CAPS2遺伝子欠損マウスの場合、覚醒中のシータ波というGABA抑制系と関係する脳波の頻度が減少することも明らかになりました。
これらの結果は、CAPS2の分泌増強効果の欠損によってGABA作動性の抑制性神経回路が脆弱になることを示唆しています。抑制性神経細胞の生存と分化には、BDNFが重要であることから、CAPS2はBDNF分泌を増強することによって、抑制性神経回路の正常な発達と機能発揮を促している、という細胞生物学的な意義が分かりました。
（3）マウス行動解析
正常マウスとCAPS2遺伝子欠損マウスの不安様行動評価、学習・記憶評価、うつ様行動評価といった行動表現型について解析を行いました。その結果、CAPS2遺伝子欠損マウスは、高所の十字アーム（高架式十字迷路テスト）では塀の無いアームには入らない、不慣れな環境下での給餌（新奇性抑制摂食テスト）では、空腹であっても摂食までの潜時が長い、8つあるアームでのアーム選択回数（8方向放射状迷路テスト）が少ない、Y字迷路でのアーム選択回数（Y字迷路テスト）が少ないといった不安様行動の増加を示しました。また、うつ様行動のテストでは、水が嫌いなマウスを水槽中に入れた時（強制水泳テスト）に、逃避行動を諦めて無動状態になる時間が長いという兆候を示しました。しかし、ほかのテストでは差が無かったことから、うつ様ではないものの、その傾向はあることが示唆できました。
今回、海馬神経細胞の蛍光イメージング解析を駆使した結果、脱分極刺激を受けた神経細胞で起きる有芯小胞の開口放出によるBDNF分泌の動的速度、頻度、量は、CAPS2によって増強されるという動態を初めて明らかにすることができました。また、組織形態学的および電気生理学的解析の結果、CAPS2の分泌増強効果の欠損がGABA作動性の抑制性神経回路を脆弱にし、海馬の抑制性シナプスの発達、抑制性シナプス電流、シナプス可塑性、脳波などでも異常を示すことが判明しました。また、CAPS2遺伝子欠損マウスは、新奇環境下などで不安様行動の亢進を示すことも明らかにすることができました。これらの結果は、CAPS2の分泌増強効果の欠損によりBDNFからGABAにつながる神経回路が脆弱になると、不安障害の発症リスクが高まる可能性を示しています（図5）。
今後の期待
この研究成果を糸口にして、脳の発達と働きにおける神経調節因子の分泌制御の基礎研究分野がさらに発展することが期待できます。不安障害の薬物療法では、GABA受容体作動薬が抗不安薬として精神安定作用を示します。また、BDNF分泌量の増減が精神疾患（うつ病、統合失調症、発達障害など）や神経変性疾患（アルツハイマー病やハンチントン病など）に関連するという報告が数多くあります。今後、CAPS2の分泌増強効果を利用した臨床への新しい応用・開発が、発達障害や不安障害のみならず精神神経疾患に対しても期待できます。