要旨
独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、ヒトES細胞、iPS細胞など（ヒトES細胞など）の多能性幹細胞※1の培養を難しくしている高頻度の細胞死※2のメカニズムを分子レベルで解明し、細胞培養の効率化と安全性を向上させる技術を開発しました。理研発生・再生科学総合研究センター（竹市雅俊センター長）器官発生研究グループの笹井芳樹グループディレクター、幹細胞研究支援・開発室の大串雅俊研究員らを中心とした研究グループの成果です。
ヒトES細胞などの培養は、マウスES細胞の培養と比べて技術上の障壁が高く、それが研究開発を遅らせる要因となっていました。例えば、ヒトES細胞などは、細胞を１つずつバラバラにしてから培養（分散培養）すると、99％という高頻度に細胞死が起こるため、細胞数を著しく損ないます。これまでに、笹井グループディレクターらは、Rho キナーゼ（ROCK）※3という細胞内のリン酸化酵素の働きを阻害すると、この細胞死を3割程度に抑制できることを発見していましたが、そのメカニズムはまったく分かっていませんでした。
今回、研究グループは、分散培養したヒトES細胞などを詳細に観察し、これらの細胞が細胞死を起こす前から、特有の「過剰な細胞運動（死の舞）」を示す現象を発見しました。その解析から、細胞死と「死の舞」の共通の原因が、細胞骨格タンパク質※4ミオシンの過剰活性化であることを解明しました。研究グループは、ミオシンの過剰活性化を抑える処理を行うと、ヒトES細胞などの細胞死を回避でき、細胞を効率良く大量培養できることも明らかにしました。また、細胞分散が、自殺スイッチ分子であるROCKを刺激することにより、ミオシンの過剰活性化を引き起こすことが、ヒトES細胞などに特有の細胞死を引き起こす直接のメカニズムであることを解明しました。
一方、研究グループは、細胞運動の調整因子として知られているRacというタンパク質がヒトES細胞などの生存を促進することも発見しました。また、細胞分散がROCKを刺激すると同時に、生存スイッチ分子であるRacの機能を抑制するために、強い細胞死が引き起こされることを明らかにしました。さらに、こうした細胞死と細胞生存の制御バランスに異常があるヒトES細胞などを生体に移植すると、腫瘍を形成する頻度が高くなることも発見しました。
この研究成果は、ヒトES細胞などの培養をさらに効率化すると同時に、再生医療への応用に必須である細胞の品質管理や安全性の向上に大きく貢献します。本研究は、文部科学省の「再生医療の実現化プロジェクト」の一環として進められ、米国科学誌『Cell Stem Cell』（8月6日付け：日本時間8月7日）に掲載されます。
背景
ヒトを含むほ乳動物の組織は、一般に再生能力が低く、いったん損傷を受けると自然には回復しにくい特徴があります。幹細胞を応用した再生医学研究は、生体内あるいは生体外で幹細胞を増やし、それを利用して組織を修復・再生することを目指しています。特に胚性幹細胞（ES細胞）や誘導多能性幹細胞(iPS細胞)は、身体のすべての種類の細胞に分化（自らの性質を不可逆的に変化させ、別の種類の細胞になること）する能力（多能性）と、試験管の中で無限に殖える能力（自己複製能）を持ち、その利用開発は、再生医療の基盤技術として大きな期待が寄せられています。
これまで研究グループは、ヒトES細胞から神経系および感覚器系のさまざまな有用細胞を試験管内で分化させることに、世界に先駆けて成功してきました。しかし、マウスなどのES細胞で急速に開発されているこの分化技術を、臨床応用のためにヒトES細胞などに適用するには、技術的に大きな障壁が存在しています。その１つが、ヒトES細胞などが培養過程のさまざまな操作で容易に細胞死を起こすことでした。ヒトES細胞などはマウスES細胞と異なり、非常にストレスに弱く、細胞培養で頻用している通常の操作でも簡単に細胞死を起こします。例えば、細胞を増殖させるためにシャーレから別のシャーレへと植え継ぐ際には、通常トリプシンなどの酵素を使って細胞を1つずつバラバラにし、新たなシャーレの上で1つ1つの細胞から細胞塊（コロニー）を形成させます。これを分散培養と呼びますが、ヒトES細胞などはこのような分散培養をすると99％の細胞が2日以内に死んでしまいます。そのため、高度な培養技術、例えば大量培養や細胞単離、遺伝子導入ができず、臨床応用への大きな障壁となっていました（図1）。
研究グループは、細胞内のリン酸化酵素の1つであるROCKに対する阻害剤を培養液へ添加するという単純な処理を行うと、分散培養におけるヒトES細胞などの生存率を70%程度まで向上させることができることをすでに発見しています（図2、2007年5月28日プレス発表）。しかし、ROCK阻害剤がヒトES細胞などの細胞死を抑制するメカニズムはまったく分かっていませんでした。そこで、研究グループは、そのメカニズムを分子レベルで解明し、細胞死を抑制する手法を開発、改良することに取り組みました。
研究手法と成果
（1）ヒトES細胞などは分散培養すると「死の舞」を踊りながら死ぬ
ヒトES細胞などは、単一細胞に分散して培養すると99％が細胞死を起こします。このような細胞死を引き起こす現象は、マウスES細胞では認められず、霊長類（ヒトおよびサル）のES細胞などに特有の現象です。今回、研究グループは、ヒトES細胞などの分散培養時の挙動をリアルタイム・イメージング法という顕微鏡下の経時観察法により、詳細に解析しました。その結果、分散培養したヒトES細胞などは、ほかの種類の細胞の分散培養時には見られない特徴的で激しい細胞運動を示すことを発見しました。
単一分散して、ほかの細胞に接しないように培養したヒトES細胞などには、分散培養直後から細胞表面に細胞膜の突起が多数認められ、顕微鏡下で経時的に観察すると、それらの突起は激しく突出と退縮を繰り返すブレビング※5という現象を起こすことが分かりました。それらの細胞の細胞膜を特殊な蛍光タンパク質を用いて可視化し観察した結果、本来は丸い細胞表面から、多数の手のような突起が出ていることが分かりました（図3）。この激しい細胞運動を数時間程度続けた後、分散培養したヒトES細胞などは細胞破裂を起こし、細胞死に至りました。この細胞運動は、細胞にとって、まさに「死の舞」といえます。
これまでもある種の培養細胞が死ぬとき、その寸前に一過性のごく短いブレビングを起こすことは知られていましたが、分散培養中のヒトES細胞などのように、何時間も続き、しかも激しいブレビングを起こす現象はこれまで報告されていませんでした。今回の詳細な解析から、ヒトES細胞などの細胞死やその前の「死の舞」は、新しいタイプの細胞死であると結論付けることができます。
（2）ヒトES細胞などの細胞死は、ミオシンの過剰活性化が直接の原因
研究グループは、このヒトES細胞などに特有の「死の舞」と細胞死との関係を分子制御レベルで詳細に解析しました。その結果、両者を引き起こす直接の原因が、細胞内のミオシンの過剰な活性化であることを突き止めました（図4）。研究グループは、ミオシンの阻害剤などを用いて、ミオシンの過剰な活性を抑制すると、分散培養で引き起こされるヒトES細胞などの細胞死をほぼ完全に抑制できることを発見しました。また、これまでに研究グループが見いだしていたROCK阻害剤による細胞死の抑制効果も、ROCKがミオシンの活性化を促進する役割を持ち、それを抑えることでミオシンの過剰な活性化を阻止できるためと分かりました。
ミオシンは、細胞の構造を支える細胞骨格タンパク質の１つで、細胞内では別の細胞骨格タンパク質であるアクチンとともに働きます。アクチンとミオシンは、筋繊維の主要な成分として筋収縮を起こしますが、筋肉以外の細胞では、細胞の形や運動をつかさどる主要な役割を果たしています。
その細胞運動制御における重要な役割から、ミオシンの過剰な活性は、ブレビングのような「過剰な細胞運動」を起こすことはある程度想定できました。しかし、ミオシンの過剰な活性が細胞死を起こす引き金になることは、予想外の発見で、ヒトES細胞などに特徴的な現象だと考えられます。詳細な分子レベルの解析から、細胞が死ぬのは「死の舞」で踊り疲れたためではなく、ミオシンの過剰な活性が、直接、細胞死プログラムを活性化するためとも判明しました。
（3）ヒトES細胞などの生存促進機能はRacというタンパク質が担い、その抑制が細胞死をさらに加速させる
研究グループは、このヒトES細胞などに特有の細胞死の制御経路を分子レベルで詳細に解明しました。その結果をまとめると、図4および以下のようになります。
①ヒトES細胞などは、隣の細胞と接していないと（細胞間接着をしていないと）細胞死のスイッチが入る。
②細胞死のスイッチは、細胞内の3つのタンパク質、Rho-ROCK-ミオシンの順に伝えられ、ミオシンの過剰活性化を引き起こす。
③ミオシンの過剰活性化は、ミトコンドリアに穴をあけて、細胞死を引き起こす。
④ミオシンの過剰活性化は、同時にブレビングという「死の舞」を誘導する。
さらに研究グループは、ヒトES細胞などにはこうした細胞死を起こりにくくするための「細胞生存の促進機構」も存在することを発見しました。その機構では、細胞運動の調整因子として良く知られているRacというタンパク質が、強く細胞死を抑制する機能を持つことが分かりました。しかし、ヒトES細胞などを分散培養すると、このRacの働きが急速に減弱することが判明しました。すなわち、ヒトES細胞などの激烈な細胞死は、「自殺スイッチ」がRho-ROCK-ミオシンで入るとともに、「生存促進シグナル」のRacが働かないという相乗効果の結果といえます。研究グループは、Abrという因子がその2つを同時に引き起こすことも明らかにしました。
（4）ヒトES細胞などの細胞死が起こらない変異株は、移植後に腫瘍を形成しやすい
ヒトES細胞などは長期に培養すると、一部の性質が変化した変異株を生じやすいことが知られています。その中には、正常のヒトES細胞などと異なり、分散培養しても細胞死をまったく起こさないものも出現します。こうした変異株の混入への対策は、ヒトES細胞などの臨床応用の安全性を考える上で、非常に重要な課題と考えられています。
研究グループは、京都大学で作製された国産のヒトES細胞を用いて、「細胞死に耐性の変異株」と正常細胞とを詳細に比較しました。その結果、「細胞死に耐性の変異株」は分散培養しても、ミオシンの過剰活性化などの自殺スイッチが入らない上に、Racによる生存シグナルも高いままの状態であることが分かりました。すなわち、「細胞死に耐性の変異株」では、細胞死と生存のシグナルのバランスが正常細胞と大きく異なっていることが分かりました。
次に、ヒトES細胞の「細胞死に耐性の変異株」と正常細胞をマウスの精巣に10万個程度細胞移植したところ、どちらの場合も奇形腫※6と呼ばれる腫瘍を形成しました。ところが、移植する細胞の数をどんどん減らしてゆくと、変異株と正常細胞とでは奇形腫の形成率が異なることが観察されました。すなわち、「細胞死に耐性の変異株」では1,000個程度の細胞でも奇形腫を形成するのに対し、正常細胞ではその5倍以上の細胞を移植しないと奇形腫を形成しにくいことが分かりました（図5）。
この結果は、細胞の生存と細胞死のバランスの異常が、腫瘍形成というヒトES細胞などの臨床応用の安全性にかかわる１つの重要な検証項目になることを示しました。
今後の展望
今回の研究では、細胞生物学の基礎研究の観点からは、これまでに知られていなかった「死の舞」を伴う新たな細胞死を発見し、その分子メカニズムをほぼ完全に解明したことが主要な成果といえます。一方、幹細胞医学の観点からは、ヒトES細胞などの培養を困難にしている高頻度の細胞死の原因を明らかにし、その回避のための戦略を示したことが重要です。具体的には、ミオシンの過剰活性化を阻害することでヒトES細胞などの分散培養を効率化できること、ヒトES細胞などの生存シグナルであるRacの機能を調整する薬剤を開発することで、さらなる生存率の向上（現在のROCK阻害剤法では、分散培養での生存率は約70%）が見込まれることです。また、研究グループは、フィブロネクチンなどの細胞外基質※7も、生存シグナルとしてある程度機能することも明らかにしています。
これらの知見に基づき、ヒトES細胞などの分散培養法のさらなる改良が進みつつあります。例えば一般にヒトiPS細胞株の多くでは、分散培養による細胞死がヒトES細胞に比べさらに高頻度で、これまで大量培養や遺伝子操作などの分散培養を必要とする手技が困難でした。研究グループは、今回の成果などからミオシンの過剰活性化を抑えるためのROCK阻害剤の濃度の調整や、細胞外基質を培養液に加えるなどの改良により、ヒトiPS細胞の分散培養を効率的に行うことも可能としました。
さらに、臨床応用に向けた安全性の観点からは、以下のような重要な意義を持ちます。ヒトES細胞、iPS細胞から、例えば、ドーパミン神経細胞や網膜細胞などを試験管内で産生し、それをパーキンソン病※8や網膜変性※9の患者に移植するといった細胞治療には多くの期待が寄せられています。こうした新規の治療では、安全性の担保が極めて重要ですが、その中で、移植後の細胞の腫瘍化を回避することが大きな課題となっています。
この腫瘍化には2つの異なるメカニズムが存在します。１つは、移植した細胞そのものががん（悪性腫瘍）化する場合ですが、神経細胞や網膜細胞、心筋細胞の場合は、こうしたがん化は起こりにくいことが知られています。もう１つは、移植した細胞に未分化なヒトES細胞などが混入して、それらが奇形腫を形成する場合です。奇形腫自身はがんではなく、転移しない良性腫瘍ですが、生じる場所によっては問題を起こす可能性があります。後者の場合、いかに未分化なヒトES細胞、iPS細胞の混入を減らすか、どの程度の数の混入までなら現実的な安全性に問題がないか、という2つの点が安全管理上の技術的課題です。
今回の研究で、混入する未分化なヒトES細胞などが「細胞死に耐性の変異細胞」であれば、正常の未分化細胞より奇形腫形成のリスクが増加することが明らかとなりました。すなわち、どの程度の数の混入までなら現実的な安全性に問題がないかという点について、単に混入する細胞の数だけではなく、混入する細胞の質が大きなポイントになることを示唆しています。従って、今後、ヒトES細胞などでは、分散培養で細胞死を確実に起こすことや、研究で明らかにした細胞死を制御する細胞内スイッチ（Rho、ROCK、ミオシン、Rac、Abrなど）が正常に働いていることを確認することが、臨床応用のための安全性の向上に非常に重要になるといえます。さらに、今回の研究から、その検証には難しい検査は必ずしも必要なく、分散した細胞の何パーセントが「死の舞」を示すか？という簡易な顕微鏡下のチェックで可能であることも分かり、今後の実用に大きく貢献することが期待されます。